Caratterizzazione molecolare, analisi dell’espressione e localizzazione cellulare dei recettori IL-4/13 in grande ombrina gialla

L’interleuchina (IL) -4 e IL-13 sono citochine di classe I strettamente correlate che svolgono ruoli chiave nella risposta immunitaria T helper (Th) -2 tramite recettori eterodimerici. IL-4 segnala tramite i complessi recettoriali di tipo I (IL-4Rα / )c) e di tipo II (IL-4Rα / IL-13Rα1), mentre IL-13 segnala solo tramite il complesso recettore di tipo II. IL-13Rα2 è tradizionalmente considerato un recettore “esca” per IL-13. Tuttavia, il sistema IL-4/13 e la sua risposta all’infezione patogena non sono ancora completamente compresi nei pesci.

In questo studio, abbiamo identificato quattro geni della subunità del recettore IL-4/13 nell’ombrina gialla grande (Larimichthys crocea): LcIL-4Rα1, LcIL-4Rα2, LcIL-13Rα1 e LcIL-13Rα2. L’analisi della sequenza ha mostrato che questi recettori possedevano domini caratteristici tipici, tra cui un peptide segnale, due domini simili alla fibronectina di tipo III (FN III) e un dominio transmembrana, ma le loro regioni citoplasmatiche non erano ben conservate.

L’mRNA e la proteina dei quattro recettori IL-4/13 sono stati espressi costitutivamente in tutti i tessuti esaminati di grande ombrina gialla. I loro mRNA sono stati rilevati anche nei macrofagi del rene primario (PKM), nei granulociti nel rene primario (PKG) e nei linfociti nel rene primario (PKL).

Il test di immunofluorescenza ha inoltre mostrato che LcIL-4Rα e LcIL-13Rα1 sono stati espressi sulla membrana delle cellule B IgM ⁺ . Dopo la stimolazione da parte di Vibrio alginolyticus e poly (I: C) (un mimico di dsRNA virale), i livelli di mRNA dei recettori LcIL-4/13 erano significativamente sovraregolati nella testa del rene e della milza.

I loro livelli di mRNA sono stati anche sovraregolati nei leucociti del rene della testa in risposta al trattamento con poli (I: C) e lipopolisaccaride (LPS). Inoltre, sia LcIL-4 / 13A ricombinante che LcIL-4 / 13B hanno sovraregolato LcIL-4Rα1 e LcIL-4Rα2 nei leucociti primari, ma solo LcIL-4 / 13A ricombinante ha sovraregolato LcIL-13Rα1 e LcIL-13Rα2. Questi risultati hanno indicato che i recettori LcIL-4/13, contenenti domini funzionali conservati, possono essere coinvolti nella risposta immunitaria mediata da IL-4/13 alle infezioni patogene nell’ombrina gialla grande.

Manipolazione di microRNA cellulari e analisi di dati di espressione genica ad alta dimensionalità utilizzando flussi di lavoro di apprendimento automatico

I microRNA (miRNA) sono elementi della rete di regolazione genica e la manipolazione della loro abbondanza è essenziale per chiarire il loro ruolo nelle condizioni fisiopatologiche. Presentiamo un flusso di lavoro dettagliato che identifica importanti miRNA utilizzando un algoritmo di apprendimento automatico.

Forniamo quindi tecniche ottimizzate per convalidare i miRNA identificati attraverso studi di sovraespressione/perdita di funzione. Nel complesso, questi protocolli si applicano a qualsiasi campo della biologia in cui vengono prodotti dati ad alta dimensionalità. Per i dettagli completi sull’uso e l’esecuzione di questo protocollo, fare riferimento a Wong et al. (2021a).

Correlare i tempi di segnalazione cellulare alla cinetica della singola molecola: un’analisi del tempo di primo passaggio dell’attivazione di Ras da parte di SOS

Son of Sevenless (SOS) è un fattore di scambio di nucleotidi guanina Ras (GEF) che svolge un ruolo centrale in numerose vie di segnalazione cellulare. Come molte altre molecole di segnalazione, SOS è autoinibito nel citosol e si attiva solo dopo il reclutamento nella membrana. Il tempo medio di attivazione delle singole molecole SOS è stato recentemente misurato essere ∼60 s, che è inaspettatamente lungo e apparentemente contraddittorio con i tempi di segnalazione cellulare, che sono stati misurati per essere veloci come alcuni secondi.

Qui, rettifichiamo questa discrepanza utilizzando un’analisi del tempo di primo passaggio per ricostruire l’effettiva tempistica di segnalazione di più molecole SOS dalla loro cinetica di attivazione della singola molecola. Insieme alle corrispondenti misurazioni sperimentali, questa analisi rivela come il tempo di risposta funzionale, composto da molte molecole ad attivazione lenta, può diventare sostanzialmente più veloce della cinetica molecolare media.

Questa conseguenza deriva dalla processività enzimatica di SOS in un ciclo di reazione altamente fuori equilibrio durante l’attivazione del recettore. Infine, rari eventi di attivazione precoce dominano le dinamiche di reazione macroscopiche.