Italian Federation of Biological Societies

Federazione Italiana Società Biologiche

Mając na celu opracowanie silnych inhibitorów β-glukozydaz, zbadano małą bibliotekę galaktonoamidyn i jedną arabinoamidynę wyprowadzoną analogicznie jako inhibitory β-glukozydazy ze słodkich migdałów. Wykazano, że pięcioczłonowy glikon w arabinoamidynie oddziałuje z donorem protonów w miejscu aktywnym enzymu zatrzymującego, ale nie z nukleofilem. W przeciwieństwie do tego, odpowiednia galaktonoamidyna z sześcioczłonowym glikonem i identycznym aglikonem oddziałuje z obydwoma promującymi hydrolizę aminokwasami w miejscu aktywnym i hamuje enzymatyczną hydrolizę β-glukozydów w zakresie niskich stężeń nanomolowych. Chociaż oba inhibitory są konkurencyjne, ich zdolność hamowania jest ponad 37 000 razy różna.

β-Glukozydaza ze słodkich migdałów (Amygdalus communis var. ‘Dulcis’) uwięziona na kulkach alginianu wapnia katalizowała syntezę rozpuszczalnego w wodzie 17-O-(D-glukopiranozylo)cholekalcyferolu. Optymalnymi warunkami reakcji były: 60% (wag./wag. D-glukozy) β-glukozydazy, 0,12 mM bufor fosforanowy o pH 6 i 30-godzinny okres inkubacji. β-Glukozydaza katalizowała również reakcję z D-glukozą 2, D-galaktozą 3, D-mannozą 4 i D-fruktozą 5 z ogólnie niską wydajnością w zakresie 3-14%. Oba anomery α/β D-glukozy 2, D-galaktozy 3 i D-mannozy 4 przereagowały, z których dwa pierwsze utworzyły również pochodne C6-O.

Podwójna rola imidazolu jako aktywatora inhibitora β-glukozydazy ze słodkich migdałów (Prunus dulcis).

Oznaczono aktywność β-glukozydazy Prunus dulcis (ze słodkich migdałów) kosztem p-nitrofenylo-β-d-glukopiranozydu przy pH 6, zarówno w stanie stacjonarnym, jak i przedstacjonarnym. Stosując surowe preparaty enzymatyczne zaobserwowano konkurencyjne hamowanie przez 1-5 mM imidazol w obu badanych warunkach kinetycznych. Jednakże, gdy do mieszanin reakcyjnych dodano imidazol w stężeniu 0,125-0,250 mM, wykryliśmy znaczną aktywację enzymu. W celu dalszego zbadania tego efektu wywieranego przez imidazol, β-glukozydazę oczyszczono do jednorodności. Wyizolowano dwie izoformy enzymu, tj. monomer pełnej długości i dimer zawierający podjednostkę pełnej długości i skróconą.
  1. Stwierdzono, że dimeryczna β-glukozydaza działa znacznie lepiej niż enzym monomeryczny, niezależnie od warunków kinetycznych stosowanych do oznaczenia aktywności enzymu. Ponadto stwierdzono, że wrażliwość obu izoform na imidazol różni się.
  2. Chociaż rzeczywiście stwierdzono, że enzym monomeryczny jest stosunkowo niewrażliwy na imidazol, zaobserwowano, że dimeryczna β-glukozydaza jest znacząco aktywowana przez 0,125-0,250 mM imidazol w warunkach stanu wstępnego.
  3. Ponadto testy w stanie stacjonarnym wykazały, że dodanie 0,125 mM imidazolu do mieszanin reakcyjnych zwiększa Km enzymu dimerycznego z 2,3 do 6,7 mM. Proponuje się, że aktywacja dimeru β-glukozydazy przez imidazol odbywa się poprzez przejście konformacyjne pozycjonujące enzym w kierunku sprawnej katalizy.

Analiza liazy mandelonitrylowej i  beta – glukozydazy  ze  słodkich  migdałów  kombinowanymi technikami elektroforetycznymi

Migdały są bogatym źródłem liazy migdałowej (oksynitrylazy) i beta-glukozydazy. Izolacja tych dwóch enzymów ze słodkich migdałów wymaga frakcjonowanego wytrącania siarczanem amonu, a następnie chromatografii jonowymiennej na kolumnach dietyloaminoetylo-(DEAE) i karboksymetylocelulozy (CMC). W niniejszym badaniu do scharakteryzowania tych dwóch enzymów zastosowano różne techniki elektroforetyczne, takie jak elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), ogniskowanie izoelektryczne w unieruchomionych gradientach pH (IEF-IPG) i elektroforeza kapilarna.
Po raz pierwszy beta-glukozydaza i oksynitrylaza zostały rozdzielone w unieruchomionym gradiencie pH równym jednej jednostce pH. Elektroforeza strefowa kapilarna (CZE) była doskonałym narzędziem do analizy czystości preparatów enzymatycznych, umożliwiając całkowite oddzielenie różnych składników białkowych w zaledwie 15 minut. CZE wykazał zdolność rozdzielczą do rozdzielania form enzymów porównywalną z ogniskowaniem izoelektrycznym w unieruchomionym gradiencie pH.

Lascia un commento

Il tuo indirizzo email non sarà pubblicato.